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Procédure de coloration de Gram en microbiologie

Procédure de coloration de Gram en microbiologie

La coloration de Gram est une méthode de coloration différentielle utilisée pour attribuer les bactéries à l'un des deux groupes (gram positif et gram négatif) en fonction des propriétés de leurs parois cellulaires. Il est également connu sous le nom de coloration de Gram ou méthode de Gram. La procédure porte le nom de la personne qui a développé la technique, le bactériologiste danois Hans Christian Gram.

Comment fonctionne la coloration Gram

La procédure est basée sur la réaction entre le peptidoglycane dans les parois cellulaires de certaines bactéries. La coloration de Gram implique la coloration des bactéries, la fixation de la couleur avec un mordant, la décoloration des cellules et l’application d’un colorant.

  1. La tache primaire (cristal violet) se lie au peptidoglycane, colorant les cellules en violet. Les cellules gram-positives et gram-négatives ont du peptidoglycane dans leurs parois cellulaires, de sorte que toutes les bactéries se colorent d'abord au violet.
  2. L'iode de Gram (iode et iodure de potassium) est appliqué en tant que mordant ou fixateur. Les cellules à Gram positif forment un complexe cristal violet-iode.
  3. L'alcool ou l'acétone est utilisé pour décolorer les cellules. Les bactéries à Gram négatif ont beaucoup moins de peptidoglycane dans leurs parois cellulaires, cette étape les rend donc essentiellement incolores, tandis que seule une partie de la couleur est éliminée des cellules à Gram positif, qui contiennent plus de peptidoglycane (60 à 90% de la paroi cellulaire). L'épaisse paroi cellulaire des cellules à Gram positif est déshydratée par l'étape de décoloration, ce qui entraîne leur rétrécissement et le piégeage du complexe colorant-iode à l'intérieur.
  4. Après l'étape de décoloration, un contre-colorant est appliqué (généralement de la safranine, mais parfois de la fuchsine) pour colorer les bactéries en rose. Les bactéries à Gram positif et à Gram négatif ramassent la tache rose, mais elle n'est pas visible sur le pourpre plus foncé des bactéries à Gram positif. Si la procédure de coloration est effectuée correctement, les bactéries à Gram positif seront violettes, tandis que les bactéries à Gram négatif seront roses.

But de la technique de coloration de Gram

Les résultats de la coloration de Gram sont visualisés en microscopie optique. Parce que les bactéries sont colorées, non seulement leur groupe de coloration de Gram est identifié, mais leur forme, leur taille et leur motif de mottes peuvent être observés. Cela fait de la coloration de Gram un outil de diagnostic précieux pour une clinique ou un laboratoire médical. Bien que la tache puisse ne pas identifier avec certitude les bactéries, il suffit souvent de savoir si elles sont gram-positives ou gram-négatives pour prescrire un antibiotique efficace.

Limites de la technique

Certaines bactéries peuvent être gram-variable ou gram-indéterminée. Cependant, même cette information peut être utile pour réduire l'identité bactérienne. La technique est la plus fiable lorsque les cultures ont moins de 24 heures. Bien qu'il puisse être utilisé sur des cultures en bouillon, il est préférable de les centrifuger en premier. La principale limitation de la technique est qu’elle donne des résultats erronés si des erreurs sont commises dans la technique. La pratique et les compétences sont nécessaires pour produire un résultat fiable. En outre, un agent infectieux peut ne pas être bactérien. Les agents pathogènes eucaryotes se colorent par Gram négatif. Cependant, la plupart des cellules eucaryotes, à l'exception des champignons (y compris la levure), ne collent pas à la lame pendant le processus.

Procédure de coloration de Gram

Matériaux

  • Crystal violet (tache primaire)
  • Gram's iode (mordant, pour fixer le cristal violet dans la paroi cellulaire)
  • Éthanol ou acétone (décolorant)
  • Safranine (coloration secondaire ou contre-colorant)
  • Eau dans une bouteille de jus ou une bouteille compte-gouttes
  • Lames de microscope
  • Microscope composé

Notez qu'il est préférable d'utiliser de l'eau distillée que de l'eau du robinet, car les différences de pH dans les sources d'eau peuvent affecter les résultats.

Pas

  1. Placez une petite goutte d'échantillon bactérien sur une lame. La chaleur fixe les bactéries à la lame en la faisant passer trois fois à travers la flamme d’un brûleur Bunsen. L'application de trop de chaleur ou pendant trop longtemps peut faire fondre les parois des cellules de la bactérie, faussant leur forme et conduisant à un résultat inexact. Si trop peu de chaleur est appliquée, les bactéries vont laver la lame pendant la coloration.
  2. Utilisez un compte-gouttes pour appliquer la tache primaire (cristal violet) sur la lame et laissez-la reposer pendant 1 minute. Rincez doucement la lame avec de l'eau pas plus de 5 secondes pour enlever l'excès de tache. Un rinçage trop long peut enlever trop de couleur, mais ne pas le rincer assez longtemps peut laisser trop de taches sur les cellules gram-négatives.
  3. Utilisez un compte-gouttes pour appliquer l'iode de Gram sur la lame pour fixer le cristal violet à la paroi cellulaire. Laissez-le reposer pendant 1 minute.
  4. Rincer la lame à l’alcool ou à l’acétone environ 3 secondes, puis immédiatement à l’eau douce. Les cellules à Gram négatif perdront leur couleur, tandis que les cellules à Gram positif resteront violettes ou bleues. Cependant, si le décolorant reste allumé trop longtemps, toutes les cellules perdront leur couleur!
  5. Appliquez la teinture secondaire, safranine, et laissez-la reposer pendant 1 minute. Rincez doucement avec de l'eau pas plus de 5 secondes. Les cellules Gram-négatives doivent être colorées en rouge ou en rose, tandis que les cellules Gram-positives apparaissent toujours en violet ou en bleu.
  6. Voir la diapositive à l'aide d'un microscope composé. Un grossissement de 500x à 1000x peut être nécessaire pour distinguer la forme et la disposition des cellules.

Exemples d'agents pathogènes à Gram positif et à Gram négatif

Toutes les bactéries identifiées par la coloration de Gram ne sont pas associées à des maladies, mais voici quelques exemples importants:

  • Cocci à Gram positif (rond) -Staphylococcus aureus
  • Cocci Gram négatif -Neisseria meningitidis
  • Bacilles à Gram positif (bâtonnets) -Bacillus anthracis
  • Bacilles à Gram négatif -Escherichia coli